阿尔伯特·诺贝尔于1896年12月10日在意大利北部的圣雷莫市去世，身后留下了一份著名的遗嘱，这才有了最初的五项诺贝尔奖。
事实上，诺贝尔的遗嘱有好几个版本。1889年11月11日，他给一位朋友写信时首次提到了遗嘱问题：“我的一位老侍者总在问，我死后他是否能得到什么。但他哪里知道，我还没立什么遗嘱。我的确写过一次，但又撕掉了。”
第二个版本的遗嘱写于1893年。其中，他只写明遗产的20%归他的亲戚、合伙人和男女佣人，一共22位；16%归不同的机构，包括巴黎瑞典俱乐部、斯德哥尔摩学院、斯德哥尔摩医院和卡罗林斯卡医学院。这些钱将组成一项基金，“将利息奖给在生理学或医学领域作出最重要和最伟大发现的人，每三年一次”；余下的64%将赠给斯德哥尔摩自然科学院，也作为一笔基金，将它的年利息奖给在自然科学领域、生理学或医学领域有最重要或具有开创性发现的学者，不论男女，不论瑞典人和外国人，都有资格享受。这个版本里没有提到文学奖。
1895年，他又对遗嘱进行了修改，这就是1895年版本。遗嘱说，将其投资于证券的资金组成一笔基金，每年将基金的利息以奖金的方式奖给在过去一年中对人类作出重大贡献的人。奖金分成五个数额相等的部分，其获奖标准分别是：在物理领域有最重要的发现或发明；有最重要的化学发现或改进；在生理学或医学领域有最重要的发现；在文学领域创作出最杰出的理想主义倾向作品；为民族和解、消除或减少常备武装、维护或促进和平进程做了最多或最好的努力。
1896年夏天，诺贝尔将这最后的遗嘱版本交给了斯德哥尔摩私人银行，并在巴黎瑞典俱乐部得到见证。在这最后版本中，诺贝尔给他亲戚的财产数额从开始的270万瑞典克朗减到了约100万瑞典克朗。
1897年4月26日，负责评选和平奖的挪威议会首先通过了诺贝尔的遗嘱。由于诺贝尔的遗产数额巨大，遗嘱又牵涉到许多人，瑞典的有关机构花了几年时间才分配清楚。与诺贝尔其他四项奖有关的机构卡罗林斯卡医学院、瑞典文学院和皇家科学院分别于1898年6月7日、9日和11日通过了遗嘱。这样，诺贝尔遗嘱才算正式确立。
1900年6月29日，诺贝尔基金会的章程正式确定。这一天，也正是诺贝尔基金会正式成立的日子。
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